慢病毒穩轉株構建流程及事項

　　慢病毒穩轉株構建流程及事項：

　　1.慢病毒載體構建，過表達載體或者干擾載體構建

　　慢病毒過表達載體有基因容量限制，對于大于5k的基因，包裝出慢病毒的概率很低，不建議包裝病毒。同時大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式實驗之前，可用先進行病毒的小量包裝，成功后再進行病毒大量包裝。對于敲低，通常的策略是對一個基因同時選擇3個干擾靶點，通過qPCR驗證干擾效率之后，使用效率好的靶點進行下一步實驗。

　　慢病毒載體帶有不同的標簽，如果研究細胞定位，可以選擇帶熒光標簽的慢病毒載體，比如帶GFP/RFP等；如果準備篩選穩轉細胞株，可以選擇帶篩選標簽的慢病毒載體，比如puro/neo等載體；如果目的基因大小適中，也可以選擇同時帶熒光標簽和篩選標簽的載體。

　　2.293T細胞培養及慢病毒包裝

　　細胞的狀態對于病毒包裝有很大的影響，如果細胞狀態不好可能不出毒或者出毒量很低。取狀態良好，處于對數生長期的293T細胞進行慢病毒包裝。第三代四質粒包裝質粒配比，可以按照分子量來折算，并在附近量做實驗，摸索最適質粒配比，以得到更高滴度的病毒。

　　3.慢病毒滴度檢測及保存，使用熒光梯度稀釋法或者qPCR法檢測

　　慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后72小時后觀測熒光表達或者qPCR檢測。感染期間請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態。值得考慮的是使用低濃度的血清來培養細胞，作用是抑制細胞增殖。

　　特別注意慢病毒可以存放于-80℃6個月以上，但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前重新滴定病毒滴度。反復凍融會降低病毒滴度，每次凍融會降低病毒滴度10%，因此，在病毒使用過程中應盡量避免反復凍融，強烈建議收到病毒后按照每次的使用量將病毒進行分裝。

　　4.目的細胞MOI值摸索，確定最適慢病毒感染復數

　　同一種細胞在不同實驗室中由于傳代次數、操作細節的不同，細胞狀態會有所差異，另一方面病毒液在運輸、保存過程中可能造成即時滴度的變化。因此為了達到理想的實驗效果，建議在正式實驗前進行3-4種不同MOI的感染預實驗。細胞匯合度對抗生素篩選結果的影響很大，一般篩選時細胞匯合度不宜超過50%。

　　5.目的細胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實驗

　　使用不同濃度的抗生素對細胞進行處理，選擇出在10-14天內使細胞全部死亡的低抗生素濃度來進行下一步的篩選試驗。不同的細胞對于同一種抗生素，其篩選濃度不同，而同一種細胞對于不同的抗生素，其*使用濃度也不同。所以在進行穩轉株篩選之前，一定要先進行藥物濃度篩選預實驗以確定*藥物篩選濃度。

　　6.慢病毒感染目的細胞及多/單克隆穩轉株篩選

　　由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質，所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，終導致篩選不出陽性克隆。一般在轉染24小時之后才開始加抗生素記性篩選。加藥篩選后，死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有抗生素表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液。